Схема технологий эмбриональных стволовых клеток


Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Обратные
ссылки


Считается, что стволовую клетку определяют два свойства - способность к длительному самовозобновлению без старения и плюрипотентность , способность дифференцироваться в один или множество специализированных типов клеток. Следовательно, теоретически эти клетки могли бы обеспечить неистощимый источник клеток для трансплантации. Тотипотентные стволовые клетки, обладающие способностью генерировать все типы тканей, играют решающую роль в развитии человеческого организма, обеспечивая "сырье" для развития всех органов и тканей эмбриона и внеэмбриональных тканей. Однако, тканеспецифические стволовые клетки расположены также в различных "нишах" организма, таких, как костный мозг, печень, мозг и кожа для обеспечения механизма поддержания ткани, ее роста и регенерации ( Lavker и Sun, 2000 ; Uchida и др., 2000 ; Vessey и de la Hall, 2000 ; Wagers и др., 2002 ).

Первоначально предполагалось, что эти "взрослые" стволовые клетки осуществляют регенерацию лишь очень незначительного числа типов клеток; однако, становится все более очевидным их существенно большая пластичность ( Blau и др., 2001 ; Morrison, 2001 ; Prockop и др., 2003 ). Теоретически эти клетки могут быть взяты у пациента, дифференцированы в лаборатории и трансплантированы тому же пациенту для восстановления ткани, что решает, таким образом, проблему иммунного отторжения. Однако, для некоторых типов стволовых клеток низкая частота встречаемости, трудности при доступе к их местонахождению и выделении, ограниченный потенциал развития и плохой рост в клеточной культуре могут сделать их бесполезными для целей конструирования тканей ( Vogel, 2001 ). В этих случаях ЭС клетки представляют собою более адекватный ресурс.

Эмбриональные стволовые клетки - ЭСК являются идеальной системой для направленного переноса мутаций в геном млекопитающих  [ Evans M.G., Kaufman M., 1981 ; Erickson R.P., 1988 ; Labosky P.A. et al., 1994 ].

Первичные культуры этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней клеточной массы) или из первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей. При выращивании на питательном слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недифференцированном состоянии от 3 мес. до 1 года. При этом они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель (полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и могут участвовать в формировании практически всех эмбриональных зачатков и органов развивающегося зародыша. В результате образуется животное - химера - состоящее из клеточных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по генам окраски шерсти, животное-химера - будет иметь поперечную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, независимым образом полученные в результате введения в одинаковые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки и дали начало полноценным зрелым гаметам, будут устойчиво передавать своим потомкам генетическую информацию, содержащуюся в ЭСК. Таких животных иногда называют зародышевыми трансмиттерами . При скрещивании их с мышами дикого типа часть потомков будут уже гетерозиготны по мутантным генам ЭСК, т. е. будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом типе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, предварительно искусственно введенным в ЭСК. Скрещивая такие гетерозиготы, можно получить животных, гомозиготных по заданной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном состоянии у животных этого вида.

Возможность вести селекцию нужных мутантных или трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в качестве клеточных векторов нашла широкое применение в генетическом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обрабатывали различными мутагенами ( этилнитрозомочевиной ), отбирали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру . Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Нихана - мутация гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы [ Hooper M. et al., 1987 ].

С разработкой технологии адресной доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генетического моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специфическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомологичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомбинантной ДНК сохраняются там в течение 2-3 дней в виде кольцевых эписом и в дальнейшем теряются, либо происходит интеграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации , т. е. в случайные сайты хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК может быть повышена при использовании линейных плазмид и специальных, преимущественно ретровирусных векторов , экзогенной ДНК.

Случаи стабильной интеграции экзогенной ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего в качестве маркера используют прокариотический ген nео , сообщающий клеткам устойчивость к неомицину . Клетки, в которых произошла интеграция такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418, содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток будут в этих условиях деградировать.

Эта новая технология революционизировала трансгеноз. [ Jaenish, 1989 , Bronson ea 1994 , Kilby ea 1993 , Wagner, 1990 , Hanahan, 1989 , Pascoe ea 1992 , Joyner, 1991 , Capecchi, 1989 , Capecchi, 1989 ]. Посмотрите на Рис. 5 . Там показана схема получения эмбриональных стволовых клеток [ Pascoe ea 1992 , Capecchi, 1989 ].

Возьмем 4,5 дневную предимплантационную бластоцисту . Внутреннюю клеточную массу из бластоцисты поместим на монослой клеток, которые поставляют матрикс для прикрепления и ростовые факторы (это так называемые фидерные, питающие клетки ).

Ростовые факторы поддерживают плюрипотентный характер стволовых клеток , ингибируя их дифференцировку. В таких условиях клетки внутренней клеточной массы пролиферируют и в подходящее время ее удаляют микропипеткой.

Диспергируют полученные клетки и высевают на новый фидерный слой. Выросшие колонии исследуют под микроскопом и отбирают те из них, которые имеют характерную морфологию ES клеток Берут подходящие колонии. ресуспендируют и высевают на фидерный слой. В результате получают колонии ES клеток, сохраняющие плюрипотентность и способные давать химерных животных .

Проделаем эксперимент, схематически представленный на рис. 6 .

Возьмем полученные эмбриональные клетки от черной гомозиготной мыши и введем в бластоцисту мыши, гомозиготной по аллели albino.

Подсадим эту бластоцисту ложнобеременной мыши и позволим ей родить потомство. В потомстве получатся химерные мыши, содержашие как клетки - потомки черной гомозиготы, так и клетки-потомки белой гомозиготы. Это понятно? Шкурка этих мышей будет пятнистой. Эта пятнистость и есть знак химеризма.

Скрестим полученных химер с гомозиготными альбиносами. В потомстве получим какое-то количество черных мышей. Эти черные мыши получились в результате того, что часть подсаженных эмбриональных стволовых клеток от черной мыши включила содержащуюся в них информацию в клетки зародышевого пути потомства. Это очень важный результат, показывающий, что такой путь можно использовать для создания трансгенных животных.

Теперь можно использовать ES-клетки для того, чтобы ввести в них чужеродную ДНК. Это можно сделать разными способами, например, электропорацией или с помощью ретровирусов. Обычно используют первый из них. И затем можно селектировать те клетки, которые получили и стабильно поддерживают чужеродную ДНК. Отобрав нужные клетки in vitro, введем их в мышь точно так, как это было рассказано только что. Трансдуцированные клеточные клоны сохраняют плюрипотентный характер.

Вам уже ясно, что мы революционизировали весь процесс? Вместо того чтобы отбирать трансгенных животных, мы селектируем стволовые клетки, используя прекрасно развитые методы генетики соматических клеток .  См. Трансгенные организмы: использование клеток линий ES и EK

Смотрите также:




Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Схема технологий эмбриональных стволовых клеток

Похожие новости:

   Интерьер спальни дизайн потолков фото
   Схема системы питания бензинового двигателя
   Огурцы зиму рецепты закручивающимися крышками
   Как сделать декоративную телегу
   Дуговой реактор своими руками